大咖講堂 | 相干拉曼散射顯微術Ⅰ

“一花一世界”，這句充滿禪意的話在微觀視野中得到完美詮釋。而構成世間萬千紛繁的原子由化學鍵聯合為分子，不同的分子往往具有特異性的化學鍵振動，成為它們的指紋特征。相干拉曼散射（Coherent Raman Scattering，CRS）顯微術便是通過探測目標分子的特征振動來提供成像所需的襯度, 同時基于非線性光學過程大大增強拉曼散射的信號，提高成像速率以及檢測靈敏度的新型顯微技術^[1][2]。

▲水分子的三種振動模式示意

1. 免標記和分子特異性：CRS 成像的信號來源于目標分子本身，無需外源標記物，也避開了藥物小分子等不易標記的問題，在活體（in vivo）觀測上更具有優勢；可對具有不同拉曼譜的分子進行選擇性成像，比如生物樣品里常見的脂質、蛋白、核酸和糖類等（如圖 1）；

2. 較高的探測靈敏度：相比于自發拉曼，成像速度一般有 3-5 個數量級的提升，一定條件下可實現視頻成像速度（每秒幾十幀）；

3. 光學層析和三維掃描：類似多光子顯微鏡的光學層析和三維成像功能；且由于所用的激發波長一般在近紅外，有較好的穿透深度和更小的光毒性。

根據非線性光學過程的不同，可將相干拉曼散射分為兩種：相干反斯托克斯拉曼散射（Coherent Anti-Stokes Raman Scattering，CARS）和受激拉曼散射（Stimulated Raman Scattering，SRS）。雖然這兩種非線性光學現象很早就被發現（上世紀 60 年代），但長期僅作為光譜學測量手段，直到 1999 年以及 2008 年，哈佛大學謝曉亮教授才分別將它們以實用顯微成像技術推廣開來^[4][5]。

自發與相干拉曼散射的能級示意圖見圖 2。自發拉曼只需要一束激發光，稱為泵浦光（ω_p），泵浦光子與分子發生非彈性碰撞，將部分能量轉移給分子振動。因此散射出來的光相對于泵浦光將發生一系列的頻率紅移，稱為斯托克斯光（ω_s），對應到光譜儀中的一系列譜峰，成為該分子的指紋特征。泵浦和斯托克斯光子的頻率差正好共振于化學鍵的振動頻率（Ω=ω_p-ω_s），滿足能量守恒。對于相干拉曼散射，需將泵浦和斯托克斯這兩束激光同時作用于分子，當它們的頻率差（拍頻）共振于某個化學鍵的振動時，大量分子的同一個振動模式將被同步（相干地）激發起來，使得散射效率得到大大地增強。最終表現為：泵浦光減弱（受激拉曼損失，SRL）、斯托克斯光增強（受激拉曼增益，SRG），并且出現反斯托克斯（ωas=2ωp-ωs）的新頻率分量（CARS）。自發拉曼散射與熒光、吸收等同屬線性光學范疇，一般使用連續激光即可。相干拉曼與雙光子熒光、二次諧波等都屬非線性光學范疇，需使用超短脈沖激光。最常見的用于相干拉曼的光源是皮秒光參量振蕩器（OPO），輸出兩路皮秒光，一束波長固定（如 1064nm），另一束波長在近紅外區間可調，它們分別作為斯托克斯和泵浦光。調節激光波長使得我們可以改變待測拉曼頻率，選擇性地去探測不同的化學鍵/分子。

CARS 與 SRS 雖然都是三階非線性光學過程，它們之間有明顯的區別：CARS 是個四波混頻過程，產生的光子具有第三種頻率——反斯托克斯光子 ω_as，因此只需采用合適的濾波片就可以簡單地提取出來；而 SRS 是泵浦和斯托克斯光之間的相互轉化過程，泵浦光子的湮滅和斯托克斯光子的產生同時發生，但沒有產生第三種光子；因此，通常用泵浦-探測技術中常見的調制解調的方式來提取信號，需要借助鎖相放大器來實現。CARS 顯微成像技術自 1999 年被發明以來，一直受困于非共振背景信號的干擾，典型的表現為光譜發生畸變（圖 3）。在苦苦求索了近 10 年之后，謝教授課題組于 2008 年推出了 SRS 技術，完美地解決了上述問題。CARS 過程中能量被封鎖于電磁場/光子中，電子躍遷可繞過分子振動直接通過虛能級產生；而 SRS 的發生依賴于光子能量與分子振動之間的交換，具有嚴格的共振吸收特征。因此 SRS 在光譜上與自發拉曼一致（圖 3），在圖像上也不再受非共振背景的困擾（圖 4）。此外，SRS 的信號與分子濃度呈線性關系，更方便于定量解析復雜混合物體系中的各種化學成分。也因為這些特性，SRS 不斷獲得研究者們的青睞。

參考文獻：

1.Alfonso-Garcia, A., Mittal, R., Lee, E. S. & Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. J Biomed Opt 19, 71407,